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 人中性粒细胞载脂蛋白(HNL快速定量检测试剂盒(酶联免疫法)说明书


 

 


 

产品名称

通用名称:人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)快速定量检测试剂盒(酶联免疫法)

汉语拼音:Renzhongxinglixibao zaizhidanbai kuaisudingliang jiance shijihe (meilianmianyifa)

英文名称:HNL Rapid Elisa Kit

    】90人份/盒

预期用途】用于人血液、尿液等体液中HNL的定量检测。

检测原理

人中性粒细胞载脂蛋白(Human neutrophil lipocalin,HNL),又称为人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL),是人中性粒细胞二级颗粒的主要成分,在肾、肝、胃、直肠、小肠、支气管、胸腺、胰脏以及皮肤上皮组织等[3-6]也有普遍表达。病例条件下,当人外周血中性粒细胞受到刺激而活化或人体某些部位发生损伤时,HNL可由细胞内迅速释放至细胞外,引起人血液、尿液等体液中的HNL含量明显升高。研究表明,人体发生细菌感染时,由细菌活化的中性粒细胞可直接将HNL释放至血液,其血清峰值的出现明显早于肝脏细胞合成并释放的CRP的峰值[7,8];而病毒感染时则不升高。采用HNL含量检测用于区分急性细菌和病毒感染其敏感度和特异性可达97%和96%,远远高于CRP的82%和81% [2,7,8]。急性肾衰时,损伤的肾小管上皮细胞可迅速释放HNL进入血液和尿液,其峰值的出现亦较血肌酐等提早数小时[9,10]。动态监测急重症肾病患者或接受移植手术后发生移植排斥患者血液或尿液中HNL含量的变化,对于早期诊断急性肾衰竭较血肌酐等亦具有重要的参考价值。

本试剂盒采用ELISA双抗体夹心一步法,可快速定量检测人血液、尿液等体液中的HNL水平,其检测极限为0.24μg/L。反应板中包被有HNL单克隆抗体。检测时,向各反应孔内分别加入HRP标记的HNL单克隆抗体及待测样品和标准品,孵育一段时间后,反应孔内形成HNL双抗体夹心复合物,后者可催化TMB底物显色,各反应孔内的OD值与样品中的HNL含量成正比。用酶标仪检测各孔450、630nm处的OD值,根据标准品的OD值绘制标准曲线,将待测样品的OD值代入标准方程,即可计算待测样品中HNL的含量。

主要成份

 

1、酶标板………96孔×1      2、标准品………1ml×7

3、酶标抗体……6ml×1       4、10×浓缩洗液…40ml×1

5、样品稀释液……40ml×1    6、底物A/B………6ml×2

7、终止液………6ml×1       8、封孔膜…………2张

说明:

1、不同批号试剂盒中各组份不可互换使用。

2、标准品和质控品为经HNL纯蛋白标定的稀释健康人血清,其中HNL含量在0.24~10ug/l范围内呈良好线性。

储存条件及有效期

1、本试剂盒放置2-8℃储存。

2、试剂盒有效期自检定合格之日起1年。打开包装后,酶标板有效期为7天。

适用仪器

全自动定量绘图酶标仪,低速离心机,37℃水浴箱,洗板机或者洗瓶,可调微量移液器,多道微量移液器。

样品要求

    本试剂盒的检测样本为血清、血浆及尿液。

血液样品(抗凝/非抗凝)采集后应于泡沫试管架中放置30分钟,或者室温(20-25℃)静置1-2小时,再经3000rpm离心10 min,吸出上清,并用样品稀释液稀释50倍进行检测。尿液样品采集后,应以1500rpm离心5分钟,吸出上清,再用样品稀释液稀释20~50倍,进行检测。如不能及时检测,可将血清、血浆或尿液等样本稀释后放置2-8℃保存,于72小时内检测。或将样品冻存,并择机检测,但应避免反复冻融。检测样本不应溶血或含有叠氮钠(NaN3)以免影响结果。

检测方法

实验前准备:

1、将试剂盒内各试剂平衡至室温(18-25℃)。

2、用纯化水将10×浓缩洗液按1:9体积比稀释成工作液。

3、用样品稀释液按1:50稀释待测样品。

检测步骤:

1、取出酶标板,向每个反应孔内加酶标抗体各50ul。

2、根据检测需要,向各反应孔内分别加入标准品(1-7)稀释后的待测样品,每孔50ul,用封孔膜封好。

3、将反应板放置湿盒内,于37℃孵育30分钟。

4、取出反应板,甩去孔中的液体,加入足量洗液(200uL)浸泡3分钟后,甩去孔内液体,将板倒扣在吸水纸上拍干。

5、重复“步骤5”,将反应板洗涤3次。

6、向各孔内分别加入底物A、B各50μl,用封孔膜封好,于37℃孵育15分钟。

7、向每孔内加入终止液各50μl,终止反应。

8、将反应板放入酶标仪内,检测450、630nm处各孔OD值。

9、根据酶标仪读数,以标准品的浓度值为横坐标、标准品的OD值为纵坐标绘制标准曲线,并建立标准方程(R2值应≥98%)。将各待测样品的OD值带入标准方程,计算待测样品的浓度,结果乘以稀释倍数即为待测样品的初始浓度。

检测结果的解释

  1. 参考值(参考范围):健康人(n=174)血清中HNL含量平均值为77.12ug/L,血浆中平均值为50.65ug/L,急性细菌性感染患者血清HNL含量cut-off值为164.8988,可信区间为95%。 急性肾损伤患者尿液HNL含量cut-off值为350ug/L,血浆cut-off值为400ng/L。对于感染性疾病或肾病患者,血液或尿液中的HNL含量高于相应的cut-off值时,提示发生急性细菌性感染或急性肾损伤的可能性很大。
  2. 感染性疾病患者血液中HNL含量受抗生素的影响可迅速下降,因此,应在检测前询问患者抗生素的服用情况,HNL检测值仅对未接受抗生素治疗的患者有参考价值。
  3. 本试剂盒定量范围为0.24-10μg/L,超过此范围,为标准曲线延伸计算所得,不做为准确定量结果,请用稀释液稀释后测定准确结果(0.24-10μg/L范围内),再乘以总稀释倍数即为样本最终浓度
  4. 每次检测时都应绘制标准曲线。仅当R2≥0.98,质控值在±15%范围内时,结果有效。否则,应重复进行检测。
  5. 溶血性和有细菌污染的样品可产生非特异性高测量     值,此时,应采集患者新鲜体液样品,重复检测。
  6. 检测结果受实验者操作熟练程度、样品溶血及新鲜程度影响,可疑结果应重新采集患者样本,重复检测。

检测方法的局限性

对于合并急性细菌性感染、急性肾衰或者肿瘤、心血管疾病、血液疾病或接受移植手术后发生移植排斥的患者,或当HNL含量检测与临床诊断结果矛盾时,应以临床诊断金标准为准,并结合具体情况综合判断。

产品性能指标

本试剂盒检测样品浓度在0.24~10/L之间呈良好线性。

注意事项

  1. 应严格按照说明书要求进行操作。
  2. 酶标包被板开封后如未用完,应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
  3. 对标准品、样本和空白对照做双份检测,取其平均值进行计算,可在较大程度上减小实验误差。
  4. 为避免交叉污染,标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头;酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分,要悬臂加样,不得碰到微孔;不得重复使用封板膜。
  5. 请于试剂盒保质期内使用,不同批号的试剂不得混用。
  6. 底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。
  7. 本试剂盒全部试剂含有0.1%硫柳汞,操作时应小心仔细,若不小心溅及眼内宜用大量清水冲洗干净。
  8. 试剂盒中标准品以健康人血清为原材料制备,已经甲肝、乙肝、艾滋、梅毒等常规方法检测为阴性,但仍应以具有潜在感染性物质对待。

参考文献

[1] Kjeldsen L, Johnsen H, Sengelov H, et al. Isolation and Primary Structure of NGAL, a Novel Protein Associated with Human Neutrophil Gelatinase. the journal of biological chemistry, 1993,268(14):10425-10432.

[2] Shengyuan Xu, Carlson M, Engstrom A, et al. Purification and characterization of a human neutrophil lipocalin (HNL) from the secondary granules of human neutrophils. Scand J Clin Lab Invest, 1994,54:365-376.  

[3] Hemdahl L, Gabrielsen A, Zhu C, et al. Expression of neutrophil gelatinase associated lipocalin in atherosclerosis and myocardial infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006, 26: 136-142.   

[4] Woo S, Kim M, Kang S, et al. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in human salivary glands. Ann Otol Rhinol Laryngol. 2007, 116: 599-603.   

[5] Villalva C, Sorel N, Bonnet L, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin expression in chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 2008, 49:984-988.

[6] Woo J, Min K, Bai H, et al. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin in nasal polyps. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2008, 134: 1182-186.

[7] Xu SY, Pauksen K, Venge P. Serum measurements of human neutrophil lipocalin (HNL) discriminate between acute bacterial and viral infections. Scand J Clin Lab Invest, 1995, 55(2):125-131.

[8] Xu SY, Petersson CG, Carlson M, et al. The development of an assay for human neutrophil lipocalin (HNL)-to be used as a specific marker of neutrophil activity in vivo and vitro. J Immunol Methods, 1994, 171(2):245-252.

[9] Kai M.Schmidt-Ott,Kiyoshi Mori,Jau Yi Li,Avtandil Lalandadze,et al. Dual Action of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin. Journal of the American Society of Nephrology. 18:407-413,2007.

[10] Prasad Devarajan.Emerging urinay biomarkers in the diagnosis of acute kidney injury. Expert Opin Med Diagn. 2008 April;2(4):387-398.

 

生产企业

企业名称:长春博德生物技术有限责任公司       

 

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